基于宏基因组和单细胞RNA测序的奶牛瘤胃纤维利用研究 | 微生物专题

论文标题：Investigation of fiber utilization in the rumen of dairy cows based on metagenome-assembled genomes and single-cell RNA sequencing

刊登日期：2022年1月

发表杂志：Microbiome

影响因子：14.65

技术手段：scRNA-seq、宏基因组

（一）研究背景

奶牛利用人类不可食用的低价值植物生物质来生产牛奶，这是一种具有丰富营养和高蛋白质的低成本产品。这一过程主要依赖瘤胃微生物发酵木质纤维素和纤维素以产生挥发性脂肪酸 （VFA）。VFA 被瘤胃复层鳞状上皮吸收和部分代谢，该上皮由多种细胞类型介导。本研究应用宏基因组分箱方法来探索参与纤维消化的单个微生物，并对瘤胃上皮细胞进行单细胞 RNA 测序，以研究有助于 VFA 吸收和代谢的细胞亚型。

（二）研究思路

（三）研究内容

1、宏基因组分析获得49头奶牛瘤胃微生物组成

图1 通过宏基因组装箱分析获得49头奶牛186个瘤胃MAGs

宏基因组测序从49头泌乳奶牛中共产生2,751,185,494条reads，将宏基因组测序数据(415 GB)进一步组装成34,039,290个contigs，用于重组MAGs。根据完整性和污染过滤MAGs后，从作者的数据集中总共获得186个瘤胃微生物MAGs，这些MAGs占宏基因组总reads的80.14%。所有186个MAGs的平均核苷酸同源性(ANI)均<95%，这意味着这186个物种是非冗余的。通过对这些MAGs进行分类，186个MAGs被归为细菌（图1A），其中大多数MAGs属于未培养的谱系，没有任何先前的代谢或系统发育特征。79个MAGs可分为5个门：拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和迷踪菌门（Elusimicrobia）；在科水平上，将MAGs划分为6个细菌科：普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、红蝽菌科（Coriobacteriaceae）、双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）、Elusimicrobiaceae、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）和韦荣球菌科（Veillonellaceae）（图1B）；由于瘤胃的严格厌氧环境，基于培养的方法无法全面了解瘤胃微生物，该新工具使研究人员能够了解任何微生物组的功能，并易于有效地将瘤胃微生物与表型联系起来。为了充分了解瘤胃微生物在今后生产性状改良干预中的作用，将瘤胃微生物恢复到物种甚至菌株水平至关重要。然而，与之前的宏基因组分箱研究结果一致，作者的研究结果表明，大量未分类的微生物基因组和基因组无法解析到物种水平，许多MAGs仅在界水平恢复。以往关于瘤胃微生物群落系统发育多样性普查的研究也强调未分类细菌是瘤胃微生物中最丰富的。这些结果表明，仍有大量的微生物基因组有待测序和组装。

2、MAGs的CAZome谱

图2 瘤胃MAGs的CAZyme谱

作者通过宏基因组数据集和MAGs预测了CAZyme模块，以表征奶牛瘤胃中存在的碳水化合物活性酶。共鉴定出2964个参与纤维素降解的GH家族，包括GH5、GH9、GH44、GH45和GH48；共鉴定出13,110个果胶降解家族，包括GH28、PL1、PL9、PL10、PL11、CE8和CE12。参与木聚糖降解的CAZymes数量为24,488个，其中包括GH8、GH10、GH11、GH43、GH51、GH67、GH115、GH120、GH127、CE1和CE2。然后，作者将总宏基因组预测的CAZyme与公共数据库中的CAZyme进行了比较，发现总宏基因组预测的每个CAZyme模块的数量及其在CAZy数据库中的表示形式（图2A），MAGs中有6个CAZyme模块的计数分布(图2B)。MAGs中蛋白质的分类和功能分布（图2C）显示未知细菌中CAZymes的数量最多，其次是Bacteroidetes和Firmicutes。CAZymes在细菌门中的分布（图2D）表明，GHs、GTs和CEs贡献了大多数门和未知细菌（不包括Elusimicrobia）中最多的CAZymes；CAZyme谱的表征突出了我们收集的不同微生物类群所使用的碳水化合物降解和利用策略。

3、拟杆菌门MAGs的纤维降解能力

图3 拟杆菌门MAGs的多糖降解潜力

MAG数据揭示了拟杆菌门在瘤胃碳水化合物降解中的重要糖分解作用，这一优势门MAGs编码的蛋白质能够结合和消化多种碳水化合物底物。在该研究中，拟杆菌门MAGs编码了总GHs的38.85%(GHs是一组可以水解碳水化合物之间糖苷键的酶)。然后，作者分析了GH模块的分布，以及纤维素降解、果胶降解和木聚糖降解能力在54个拟杆菌MAGs中的分布（图3）。拟杆菌基因组中最常见的10个GH家族分别为GH2、GH5、GH13、GH97、GH25、GH28、GH78、GH105、GH106和GH23。此外，重要的纤维素降解CAZymes、果胶降解CAZymes和木聚糖降解CAZymes主要由属水平的普雷沃氏菌(Prevotella）（包括MAG234和MAG196）和种水平的P. ruminicola（包括MAG156、MAG361、MAG137、MAG278、MAG174、MAG231、MAG492和MAG214）编码（图3）。CAZymes通常位于多糖利用位点（PULs）内，即编码细菌结合、转运和解聚特定聚糖结构所必需的酶的基因簇。PUL图谱显示，最常见的与CAZyme相关的PULs是参与木聚糖降解(GH43)、果胶降解(GH28)、淀粉降解（GH13和GH97），以及参与植物多糖消化和瘤胃微生物的碳水化合物降解（GH2、GH15和GH32）的辅助酶。几个含有最丰富PULs的MAGs与P. ruminicola（MAG156、MAG361、MAG208、MAG27和MAG179，99% ANI）聚集在一起，这是一种厌氧革兰氏阴性菌（拟杆菌门），可利用多种多糖作为底物（图3）。系统发育树的这一分支可能是含有新型多糖降解活性酶的微生物。在本研究中，瘤胃P. ruminicola拥有最多的PULs，这表明该分支具有很高的多糖降解潜力，这使得在Holstein奶牛的瘤胃中可以使用多种底物，并可能作为牛奶生物合成的重要中间代谢物贡献者。

4、泌乳奶牛瘤胃上皮单细胞图谱

图4 泌乳Holstein奶牛瘤胃上皮单细胞图谱

作者通过对来自3头泌乳Holstein奶牛瘤胃腹侧组织的20,728个优质上皮细胞进行了scRNA-seq分析（图4A）。发现了18个瘤胃上皮细胞簇（图4A）。细胞簇11、13、16为增殖的基底细胞（有丝分裂细胞，MC），表达标记基因KRT14、KRT5和MKI67，并根据其高表达的特异性基因，将其分为3个MC亚群(分别为TROAP+ MC、RRM2+ MC和MC_1)，细胞簇3、6、7和12高表达基底细胞（BC）标记基因KRT14或KRT5，并被定义为4个BC亚型（分别为KRT5+ BC_1、KRT5+ BC_2、KRT14+KRT5+ BC_1和KRT14+KRT5+ BC_2），特征是其高表达的特异性基因（图4B）。细胞簇0、4、5、8和14为颗粒细胞（GC）型，DLK2水平较高，其表达仅限于颗粒层，是角质形成细胞终末分化和角化的关键调节因子。细胞簇1、2和9被预测为三种棘细胞亚型(SC_1-3)，因为它们不表达基底细胞标记物（如KRT14和KRT5），但轻度表达棘细胞标记物KRT10或颗粒细胞标记物DLK2（图4B），这表明它们可能是介于基底细胞和终末分化的颗粒细胞之间的棘细胞类。除了高水平的棘细胞标记基因KRT10、S100A8和KRT6A外，细胞簇10、15和17特异性表达GJA1(通道间隙细胞基因标记)(图4B)；因此，将其定义为cg样SCs（通道间隙样棘细胞），免疫荧光染色进一步验证（图4C）。GSTA1编码一种保护细胞免受活性氧侵害的酶，而TMEM79在表皮完整性和屏障功能中发挥重要作用。

5、负责VFA吸收的关键细胞亚型

图5 瘤胃上皮细胞各亚型VFA吸收和代谢的功能异质性

通过分析SLC16A、SLC26A、SLC22A、SLC21A、SLC4A和SLC5A家族中基因在每种细胞类型中的表达，发现这些基因的表达模式具有细胞类型特异性，尽管其中一些基因（如SLC16A3、SLC16A7、SLC16A9、SLC16A11、SLC16A13、SLC26A3、SLC26A6、SLC22A7、SLC02A1、SLC5A8和SLC5A12）的表达百分比相对较低（图5A）。SLC16A9主要存在于BC亚型中，SLC26A2在MC_1、KRT14+KRT5+BC_2和IGFBP5+ cg样SC中检测到，但未发现显著差异；此外，编码最有可能的VFA转运蛋白的SLC4A9在IGFBP5+ cg样SC中检测到高表达水平。这些结果表明VFAs可能很少被GC细胞亚型吸收，即使这些细胞是解剖上首先接触瘤胃腔产生的VFAs的活细胞。

作者通过研究了瘤胃上皮细胞中与VFA代谢相关的基因，发现参与酮体合成的HMGCS2、HMGCL和BDH在KRT5+BC_2和三种cg样SC亚型中高表达。综上所示，TROAP+ MC、MC_1、KRT14+KRT5+ BC_2、KRT5+ BC_2、TM4SF1+ cg样SC、BPIFA2C+ cg样SC，特别是IGFBP5+ cg样SC是VFA代谢的主要细胞亚型。基因集评分分析表明IGFBP5+ cg样SC在VFA分解代谢过程(μ=0.23)和酮体生物合成过程(μ=0.58)中得分均最高（图5B）。

6、MAGs和上皮细胞参与瘤胃纤维的利用

图6 细菌基因组的代谢潜力及其与瘤胃上皮细胞的相互作用

为了解奶牛瘤胃微生物的碳水化合物降解活性和代谢潜力，以及瘤胃上皮细胞对VFA的吸收和代谢潜力，作者通过整合之前的研究结果发现，MAG137（Prevotella sp.基因组）具有用于降解所有三种底物的强编码蛋白质，可以进一步研究从瘤胃中获取碳水化合物降解酶，用于动物饲料添加剂和基于木质纤维素的生物燃料生产。在利用中间代谢物（丙酮酸）产生VFAs方面，一些基因组表现出很强的能力，其中MAG403（参与乙酸和丁酸的生物合成）、MAG482和MAG73（参与丁酸和丙酸的生物合成）在多个VFA代谢途径中发挥作用。另一方面，VFAs的高效转运机制对动物生产效率至关重要。90%以上的VFAs以阴离子形式存在，被上皮细胞以不同方式从腔内吸收到血液中，尤其是通过蛋白介导的转运机制。在IGFBP5+ cg样SC中，VFAs的细胞内分解(尤其是丁酸)可以维持VFAs通过瘤胃上皮的浓度梯度。综上所述，这些结果表明，这种上皮细胞类型可能在VFAs的摄取中发挥重要作用。

在TM4SF1+cg样SC中，我们观察到一个调控BST1表达的特异性信号通路，包括CSNK1D、CDK5、STAT3、RB1和SPIL。该通路由MAG509中唯一发现的微生物蛋白标记基因1435调控。在TM4SF1+cg样SC中检测到编码CSNK1D基因的表达，但在IGFBP5+ cg样SC中未检测到(图6B)。MAG361、MAG528、MAG578、MAG509和MAG304参与调控信号网络中TM4SF1+ cg样SC和IGFBP5+ cg样SC中GJA1和FABP4的表达（图6B）。在本研究中，微生物和瘤胃上皮细胞之间潜在的蛋白质-蛋白质相互作用是基于MAGs和RNA测序数据。由于蛋白质-蛋白质相互作用是调节宿主细胞基因表达的最相关的分子相互作用类型之一，因此本研究的综合分析有助于推断微生物蛋白通过信号网络对宿主细胞的间接影响，以及代谢物介导的微生物和瘤胃上皮细胞之间的相互作用。

（四）研究小结

本研究选取的52头泌乳中期奶牛瘤胃内容物样本进行宏基因组测序，利用宏基因组分箱法测定了186个细菌基因组的纤维消化和发酵能力，并鉴定出具有较强纤维素/木聚糖/果胶降解能力的特定细菌基因组，其与VFAs的生物合成高度相关。此外，基于20728个瘤胃上皮细胞的转录组，构建了包含18个瘤胃上皮细胞亚型的瘤胃上皮单细胞图谱。对编码VFA转运蛋白候选基因的表达谱的系统研究显示，IGFBP5+ cg样棘细胞独特地高表达SLC16A1和SLC4A9，表明这种细胞类型可能在VFA吸收中发挥重要作用，确定了微生物组和宿主细胞之间的潜在相互作用及其在调节关键瘤胃上皮细胞亚型关键基因表达中的作用。

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